联合多次检测ACA和抗beta2-GPI抗体在复发性流产中的诊断价值

联合多次检测 ACA 和抗b ₂ -GPI 抗体在复发性流产中的诊断价值 上海市第一妇婴保健院生殖免疫科鲍时华

   中国实用妇科与产科杂志 ,2007;23(10):760-762

[ 摘   要 ] 目的 探讨联合多次检测抗心磷脂抗体（ ACA ）和抗 β ₂ - 糖蛋白抗体（抗 β ₂ -GPI 抗体）对自身免疫型复发性流产的临床诊断价值。 方法 应用酶联免疫吸附 (ELISA) 法，对 417 例复发性流产患者血清中的 ACA 及抗 β ₂ -GPI 抗体进行检测。每隔 3 周一次，连续 14 次。 结果   患者抗磷脂抗体总阳性率达 21.8% ，其中 ACA 阳性率为 18.7% 、抗 β ₂ -GPI 抗体阳性率为 7.7% 、 ACA 和抗 β ₂ -GPI 抗体双阳性率为 4.6 ％。自身抗体阳性检出率随检测次数的增加而逐渐增加：在确诊的 91 例抗磷脂抗体阳性患者中，测定 4 次阳性率仅为 68.13% ； 5 次阳性率为 81.32% ，与 4 次阳性率比较差异有显著性（c 2=4.189 ， p=0.041 ）。 结论 ACA 和抗 β ₂ -GPI 抗体联合多次测定，可以提高自身免疫型复发性流产患者抗磷脂抗体检测率，减少漏诊率。为了提高自身免疫型复发性流产的诊断率，建议临床上对抗磷脂抗体的测定次数，应根据病情需要进行 5 次以上测定。

[ 关键词 ] 流产，复发性；抗心磷脂抗体；抗 β ₂ -GPI 抗体

复发性流产 ( recurrent spontaneous abortion, RSA) 是指自然流产连续发生 3 次或 3 次以上者。约 50 ～ 60 ％左右与免疫相关，其中 48.3% 属同种免疫型； 12.8% 为自身免疫型，由抗磷脂抗体综合征 (antiphospholipid syndrome, APS) 引起 ^[1] 。 APS 为自身免疫性疾病，是由两类抗磷脂抗体 (antiphospholipid antibodies, APA) 所致，一类抗体作用与磷脂，主要包括抗心磷脂抗体 (anticardiolipin antibodies, ACA) 、 狼疮 抗凝物 (lupus anticoagulant, LA) ；另一类抗体作用于磷脂结合蛋白，主要是抗 β ₂ -GPI 抗体 (Anti-β ₂ -glycoprotein I antibody) ，通过干扰依赖磷脂的各种凝血与抗凝血因子的功能而导致血栓。临床上表现有复发性静脉血栓、动脉血栓、血小板减少及习惯性流产等。 1998 年在日本召开的第九次国际抗磷脂抗体讨论会通过的国际分类诊断标准中， APS 的诊断标准包括临床表现和实验室检查两部分，如果存在一条以上临床表现和一个以上实验室检查异常则可诊断为 APS 。某些 感染 性疾病患者会出现 APA 一过性阳性，这种因感染引起的短暂的 APA 阳性并不会引起 APS 的临床症状，所以应强调诊断 APS 的实验室标准是两次以上、且每次间隔至少 6 周检测发现 APA 阳性才能确诊。但目前临床上对复发性流产患者 ACA 通常只进行 1 ～ 2 次的检测，导致 ACA 在复发性流产患者中的检测率，各家报道不一，最高可达 50% ，最低仅为 5% ，误诊率、漏诊率均较高。为提高自身免疫型 RSA 诊断的准确率，我们对 RSA 患者血清 ACA 和抗 β ₂ -GPI 抗体，进行联合多次测定，探讨联合多次测定 ACA 和抗 β ₂ -GPI 抗体对自身免疫性 RSA 的诊断价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象   2005 年 1 月～ 2007 年 4 月在上海交通大学医学院附属仁济医院妇产科复发性流产专家门诊就诊的 417 例有复发性流产史的患者，排除解剖、染色体、内分泌、感染等因素。年龄 24 ～ 43 （ 30.70 ± 3.84 ）岁，流产次数 2~7(2.10 ± 0.67) 次。

1.2 实验方法   两组均每隔 3 周取肘静脉血 3ml ，连续 14 次。采血后离心分离血清，置 -80℃ 保存。一次性对每份待检血清采用 ELISA 法检测抗 β2-GPI 抗体和 ACA 。抗 β2-GPI 抗体和 ACA 测定试剂购自 Phadia 公司 (Varelisa, Michigan, USA) 。

操作和结果判断均按试剂盒说明书进行。血清或血浆标本预先用 Serum/Plasma dilution 进行 1:101 稀释，包被板用洗板液洗板一次后，各孔依次加入标准品、质控品和待测样品 100 m L ，室温下振荡孵育 30min ，洗板三次；加入标记抗体 100 m L ，室温下振荡孵育 30min ，再洗板三次；每孔加入 100 m L TMB ，室温下避光振荡孵育 10min ，每孔加入 50 m L 终止液，在波长 450nm 处读取 OD 值，用直线拟合方式计算各样品浓度值。阳性判断标准：抗 β2-GPI 抗体大于 7.8U/ml(98% Percentile) ， ACA 大于 14.7 U/ml(98% Percentile) 。

1.3 统计学方法 用 SAS6.12 统计学软件对多个样本率进行比较（卡方检验）， P <0.05 有统计学意义。

2  结果

2.1       ACA 和抗 β2-GPI 抗体检测情况

在 417 例复发性流产患者中连续 12 次检测血清中 ACA 的阳性率为 18.7%(78/417) ，抗 β ₂ -GPI 抗体的阳性率为 7.7%(32/417) ， ACA+ 抗 β ₂ -GPI 抗体的阳性率为 4.6%(19/417) ， ACA 和 / 或抗 β ₂ -GPI 抗体的阳性率可达到 21.8%(91/417) 。经统计学分析，各组间 (ACA 、抗 β ₂ -GPI 抗体、 ACA+ 抗 β ₂ -GPI 抗体、 ACA 和 / 或抗 β ₂ -GPI 抗体组 ) 的阳性率有统计学差异 ( c ² =76.447 ， p=0.001) 。

2.2 连续多次检测 ACA 和抗 β2-GPI 抗体的情况

连续检测 3 次的阳性率仅为 12.47% ， 12 次可提高至 21.82% （见表 1 ）， 12 次后再增加检测次数不能提高阳性率。经统计学分析，各组间（ 3 次、 4 次、 5 次、 6 次、 7 次、 8 次、 9 次、 10 次、 11 次、 12 次）的阳性率有统计学差异 ( c ² =23.666 ， p=0.005) 。

表 1 连续检测抗磷脂抗体阳性的检出率

注：各组间比较，c ² =23.666 ， p=0.005

在确诊的 91 例抗磷脂抗体阳性患者中，测定 4 次阳性检出率为 68.13% ； 5 次阳性检出率则达到 81.32% （ 4 次与 5 次比较 , c ² =4.189 ， p=0.041 ）； 7 次阳性检出率为 90.11% ；大于 7 次阳性检出率则达 93.41% 以上，随检测次数的增加，漏诊率逐渐降低（见表 2 ）。

表 2  91 例抗磷脂抗体阳性在不同检测次数中的漏诊率与确诊率

注：各组间比较，c ² =146.648 ， p=0.001; 4 次 vs. 5 次 , c ² =4.189 ， p=0.041.

3  讨论

ACA 是自身免疫性抗体，自身免疫因素在习惯性流产患者中的发病作用已被证实 ^[2] 。目前已知 ACA 可能通过以下途径导致流产发生 ^[3,4,5] ： ①ACA 作用于滋养层表面的磷脂依赖抗原，影响其粘附、融合和分化过程，使合体滋养层细胞形成不足，造成子宫对胚胎接受性降低，维持妊娠的胎盘激素如 hCG 、 hPL 分泌减少； ② 干扰血栓素 A2 和前列腺环素的平衡，导致血小板聚集，形成微血栓，引起胎盘梗死，造成不良妊娠结局； ③ACA 作用于胎盘血管内皮细胞膜的磷脂上，引起胎盘血栓形成和血管收缩，胎盘血流量减少，或引起胎盘 血管炎 ，致使胎儿氧供及营养不足而死亡； ④ACA 有干扰钙依赖磷脂结合蛋白 -V 的作用，钙依赖磷脂结合蛋白 -V 是一种抗凝特性的磷脂结合蛋白，有研究发现 ACA 阳性的反复流产患者钙依赖磷脂结合蛋白 -V 明显减少。其主要的病理改变为内皮损伤、血小板聚集、高凝状态，最后导致血管内血栓形成。

ACA 在复发性流产患者中的检测率，各家报道不一，最高可达 50% ，最低仅为 5% ，我们以往的报道是 13.5% 和 14.29% ^[6,7] ，有报道在健康人群中检测率可达 5% 。这种现象的出现可能是由于诊断标准的不规范，导致抗心磷脂抗体检测的漏诊和误诊。日本 Sappora 国际研讨会发布《关于 APS 的初步分类诊断标准的国际共识声明》中明确规定抗心磷脂抗体的检测至少间隔 6 周的 2 次或 2 次以上发现阳性才可诊断为 APS ^[8] 。由于抗磷脂抗体的检测受很多因素干扰，如急性感染、高热等状态可以使 ACA 出现一过性假阳性，故抗磷脂抗体的检测应避开急性感染、高热期，且一次检测阳性不能认定为阳性。因此如何提高抗心磷脂抗体检测的准确率是临床上迫切需要解决的问题。

ACA 与磷脂的免疫病理反应是通过 β ₂ -GPI 而起作用的，近年来研究 ^[9] 发现一些 APS 患者 ACA 呈阴性，而抗 β ₂ -GPI 抗体呈阳性，抗 β ₂ -GPI 抗体也能够通过与 β ₂ -GPI 结合发挥与 ACA 相似的病理作用。b ₂ -GPI 又称载脂蛋白 H ，由肝细胞合成，是血浆中含量较丰富的一种单链糖蛋白，相对分子质量为 50000 ，在血浆中与脂蛋白结合，其第 1 、 2 、 5 功能区有大量带正电荷的氨基酸序列，与带阴离子磷脂的物质结合后，b ₂ -GPI 将其隐藏的抗原表位显露，导致抗b ₂ - GPI 抗体的产生 ^[10] 。体外试验发现 ^[11] ：b ₂ -GPI 可能具有天然的抗凝作用，抗b ₂ -GPI 抗体和带阴离子磷脂结合后可通过多种机制导致血管损伤，形成血管内皮细胞的促凝状态，血小板向内皮细胞粘附、聚集增多，干扰凝血因子和抗凝因子之间的平衡，最终可导致血栓形成。一般认为其与血栓的相关性要比 ACA 强 ^[12] 。因此，联合检测抗 β ₂ -GPI 抗体和 ACA 可增加 APA 在 RSA 中检测的准确性。本研究结果显示： ACA 阳性仅占 18.7% （ 78/417 ），抗 β ₂ -GPI 抗体阳性者占 7.7% （ 32/417 ）， ACA 和抗 β ₂ -GPI 抗体双阳性占 4.6% （ 19/417 ）， ACA 和 / 或抗 β ₂ -GPI 抗体总阳性率为 21.8% （ 91/417 ）。所以，为提高复发性流产患者 APA 的检测率及准确率，常规联合检测 ACA 和抗 β ₂ -GPI 抗体很有必要。

我们多次检测发现：连续检测 3 次的阳性率仅为 12.47% ，随着检测次数的增多，阳性率逐渐增高， 12 次检测阳性率可达 21.82% 。第 13 、 14 次阳性率与第 12 次的一致（ 21.82% ），连续检测 12 次后，再增加检测次数已不能提高阳性检出率。在确诊的 91 例 APA 阳性患者中，测定 4 次阳性检出率为 68.13% ； 5 次阳性检出率则达到 81.32% （ 4 次与 5 次相比 , c ² =4.189 ， p=0.041 ）； 7 次阳性检出率为 90.11% ；大于 7 次阳性率达 93.41% 以上，可见随检测次数的增加，漏诊率逐渐降低。因此，为减少 APA 检测的漏诊率和误诊率，建议复发性流产自身抗体病因筛查，应在排除急性感染等干扰因素的条件下，每 3 周检测 1 次，至少连续检测 5 次以上，有助于提高 APA 检出的准确率。