与IVF/ICSI相关基因印记疾病研究进展

与 IVF/ICSI 相关基因印记疾病研究进展

纪冬梅 综述 冯云 审校

                       《中国优生与遗传杂志》 2009, 17(5). 9-11. 安徽医科大学第一附属医院生殖医学中心纪冬梅

摘 要： 基因印记是表观遗传修饰的一种，基因印记对原始生殖细胞功能、配子成熟、胚胎生长发育、胎盘结构和功能以及出生后生长发育均有重要意义。整个过程中，基因组印记经历了擦除和重建和维持，其中任何一个环节出现错误都可能导致胚胎发育缺陷。IVF/ICSI等辅助生育技术的操作过程可能改变基因印记导致印记紊乱引起相关疾病。

关键词： 表观遗传修饰；基因印记；印记性疾病；IVF/ICSI

辅助生育技术(assisted reproduction techonology，ART)，包括体外受精－胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF－ET)、单精子卵胞浆内注射技术（intracytoplasmic single sperm injection,ICSI）、宫腔内人工授精（IUI）以及植入前遗传学诊断（PGD）等，从第一例试管婴儿诞生至今，辅助生殖迅速应用于临床 不孕不育 的治疗，为 不孕不育 夫妇带来了福音。由于IVF/ICSI的临床使用最普遍且涉及到配子操作、胚胎体外培养等非自然受孕过程（如药物超排卵、附睾/睾丸穿刺取精、显微注射等），其安全性一直是人们关注的热点。尤其是近年来随着表观遗传学的发展人们越来越关注ART出生胎儿基因组印记的改变所引起的基因印记疾病,主要包括Beckwith-Wiedemann syndrome(BWS)和 Angelman syndrome(AS)。本文就表观遗传修饰、IVF/ICSI相关的印记疾病及原因、机制研究进展做一综述。

1 ．表观遗传修饰与基因印记

  表观遗传修饰(epigenetic modification)，又称基因型外修饰或后成基因型修饰，它涉及对DNA双螺旋结构的修饰而没有改变DNA的碱基排列顺序，只通过甲基化导致基因沉默和恢复转录活性。表观遗传修饰主要包括DNA修饰和组蛋白修饰。表观遗传改变对哺乳动物生长发育的调控起重要作用，在不同组织发生改变的时间不同，影响和决定细胞定向分化。体内所有细胞的表型都是细胞的基因结构、表观遗传标志以及环境因素相互作用的结果 ^[1] 。

基因印记又称基因组印记、配子印记或亲源印记，是一种表观遗传修饰，指体细胞来源于不同亲代的一对等位基因发生的差异性表达，即机体仅表达来自亲本一方的等位基因，而另一方不表达或很少表达，具有以上特性的基因称为印记基因。其中，父系等位基因不表达者就称为父系印记，而母系等位基因不表达者就称为母系印记；父系印记基因主要包括 H19、IGF2R、 GRAB10、CDKN1C、 TSSC3, MASH2等，母系印记基因主要包括IGF2、PLAGL1、 PEG、 MEST等 ^[2] 。基因印记最具特征的标志是DNA甲基化/去甲基化，通常甲基化的DNA不具有转录活性，去甲基化DNA有转录活性 ^{[3] 。} 甲基化抑制基因转录的机制可能有两种：一种是特殊转录因子结合到DNA上干扰转录，另一种是甲基结合区域蛋白结到DNA阻遏转录。基因印迹不遵循孟德尔遗传定律，是一种非遗传性基因调控方式，解释了许多孟德尔遗传规律不能解释的现象。基因印记缺陷包括DNA甲基化修饰异常（低甲基化、超甲基化、甲基化缺失等）及组蛋白乙酰化、甲基化异常等。

目前，已经明确的人类印迹基因大约有80个左右，与胚胎的生长发育有密切关系。有研究表明基因印迹在配子形成时期即开始建立，并能够在以后配子发育和胚胎植入前早期保持完整 ^[4] 。印记基因的特点主要包括：印记基因通常成簇存在，很少是单独存在；一般都有印记中心即差异甲基化区DMR(differentially methyiated region，DMR)；在印记基因的DMR内，有富含CpG的CpG岛(CpG island)； 基因印记的过程包括印记形成、维持和擦除，在生殖细胞系印记过程是可逆的。

并非所有印记基因都能编码蛋白质，有的编码非翻译的RNA、反义RNA或小RNA，可能在基因表达调控中起到重要作用 ^[5] ，其调控机制有待进一步研究。 最早发现的印记基因包括IGF2和H19，二者均位于11号染色体短臂15区5带 (1lp15．5)。染色体1lp15．5 的印记基因调控位点从功能上可分为两个：IGF2、H19存在于位点1，IGF2为母系印记可表达胎儿生长因子，H19为父系印记表达非编码RNA；位点2包括印记基因CDKN1C、 KCNQ1、 KCNQ1OT1等 ^[6] 。

2 ．基因印记疾病与IVF/ICSI相关性

1．基因印记疾病及其危害

     Beckwith-Wiedemann syndrome是一种以过度生长为特点的基因印记异常相关疾病，典型的临床表现有：巨舌症、出生前/后过度生长、前腹壁缺陷（脐疝）等，也可出现 肥胖 、新生儿低血糖、面部红斑、耳部凹陷皱褶、肾脏异常以及胚胎性肿瘤如肾母细胞瘤、肝母细胞瘤等；目前认为BWS的发生与染色体1lp15．5位点KCNQ1、IGF2-H19、CDKN1C等基因印记异常有关。

Angelman syndrome是一种罕见的神经系统障碍综合征，特征性临床表现包括小头畸形、严重精神发育迟滞、多动、易兴奋、智力障碍、共济失调、严重运动及语言障碍、躯干肌张力降低，四肢肌张力增高等，呈特殊面容。AS发生的机制涉及染色体异常、印记缺陷、UBE3A基因突变及不明原因的遗传缺陷。按发病机制可将AS综合征分为5个类型：I型为染色体15ql1-13缺失（约占7O％）；Ⅱ型为单亲二倍体(占5％)；Ⅲ型为印记缺陷(占51O％） ^[7] 。通过对AS患者基因型－表型的研究发现I型和V型危害最大，表现为明显的发育迟滞、 癫痫 发作频率高及显著的EEG异常 ^[8,9] ；Ⅱ型和Ⅲ型表现相对较轻；Ⅳ型介于轻重之间， 癫痫 发作情况、小头畸形与Ⅰ、Ⅴ型相似，运动及语言障碍较轻，具体机制仍不明确 ^[10] 。

2. 相关性临床及基础研究

至今关于IVF/ICSI是否会真的增加基因印记疾病的风险仍存在一定的争议，但是引起人们越来越多的关注。早在2000年就有动物研究发现胚胎体外培养会引起基因印记缺陷而影响早期胚胎发育导致出生后缺陷 ^[11] 。2002年Cox等 ^[12] 第一次报道两个ICSI受孕出生子代出现AS,并且发现2例患者均存在15号染色体上印迹基因的缺失。2003年又有一例ICSI后代患有AS并伴有印记缺陷 ^[13] 。Ludwing等收集16例不育夫妇（不育＞2年或接受助孕治疗）所生AS患者，其中有4例印记缺陷者，其中ICSI助孕和激素治疗各1例，通过比较相对危险度（RR）发现不育夫妇更容易生出印记缺陷引患AS的孩子（12.5％ vs 4％） ^[14] 。以上研究报道与ART相关的AS并非由最常见染色体异常引起，而且均与基因印记缺陷有关，均为ICSI助孕后代，推测其发生可能与ICSI助孕过程中促排卵、显微操作、体外培养等有关 ^[12-14] 。

随后有许多研究报道IVF/ICSI会增加子代患BWS的的风险。2003年有报道65例IVF生出3例BWS患儿3/65 （4.6%），比整个美国普通人群的BWS发生率0.8%高出约6倍。在7例ART出生BWS患者中，5例是ICSI助孕出生；分子生物学检测发现5例有特异的表观遗传改变（4例LIT1基因印记改变，1例LIT1、H19均发生异常） ^[15] 。, Mather等回顾研究大量的散发BWS病例，在诊断出的149例BWS病例中6例是经ART（3例IVF、3例ICSI）出生的，与普通人群的发病率1.2%相比较，ART与BWS的关联性比正常妊娠出生者高4倍。其中2例存在KCNQ1OT1印迹丢失，由于IVF、ICSI均可增加BWS发生，推测印记基因甲基化缺失可可能与体外胚胎培养有关 ^[16] 。

Halliday等分析维多利亚1983－2003年间自然出生的1316500例中有37例BWS患者（约1/35580），同期出生的IVF子代14894例中有4例BWS患者(约1/4000)，通过比较表明IVF后代BWS比普通人群高出9倍，而且7例经ART出生的BWS患者，其中6例存在KCNQ1OT1或H19的印迹缺失，可能与体外培养条件或配子/胚胎暴露在特殊的培养基或生长因子中有关 ^[17] 。

但是并非所有研究报道都认为IVF/ICSI会增加印记疾病的风险。一项研究分析92例ICSI后代未发现15号染色体上有基因印迹异常, 认为ICSI后代中没有出现DNA甲基化缺失风险增高 ^[18] 。Lidegaard等 ^[19] 分析丹麦IVF助孕出生的6052个儿童印记疾病的发生率与自然受孕的442349个儿童发现IVF并没有增加印记疾病的潜在风险。

BWS涉及染色体11p15.5印记基因簇的异常基因主要包括IGF2、 KCNQ及CDKN1C等。一种机制是母系印记基因KCNQ1低甲基化或甲基化缺失，这种甲基化异常会引起KCNQ1过度表达，从而导致其附近的CDKN1C基因表达下降。CDKN1C是一种生长抑制基因，它的表达下降会导致过度生长、器官增大。最近有研究 ^[20] BWS患者的IGF2基因印记缺陷与KvDMR1位点母源性特异等位基因甲基化缺失（LOM）引起的CDKN1C的表达下降相似。通过分析人和小鼠IGF2基因三个差异甲基化位点（DMRs：DMR0,DMR1,DMR2），发现在DMR0有四个SNPs包括T123C、G358A、 T382G 及 A402G，这几个SNPs有3/16的可能出现单元型为TGTA、CATG及CAGA。对73例散发BWS患者和健康对照组的DMR0 SNPs进行DNA分析发现病例组CAGA出现的频率显著增高而CATG出现的频率显著降低。同时发现以上现象在KvDMR1 LOMT BWS患者也有非常显著，表明382G SNP上的G等位基因与KvDMR1上的LOM有关。

3．相关性机制研究

普通人群中发现的BWS和AS既包含父系等位基因的重复又包含母系等位基因在不同的印迹区域的功能缺陷，而与ART相关的AS和BWS主要机制是母系等位基因上的甲基化丢失。配子印记在雌性和雄性发生的时间不同 ^[21,22] ，精子早在早孕期原始生殖细胞转移到生殖脊后一旦在生殖脊印记擦除，便进入减数分裂I和II。印记序列在出生前甚至在精子生成完成前 ^[17] 。雌性原始生殖细胞也经历相似的过程转移到生殖脊并擦除原先的甲基化印记，但卵子的减数分裂I期开始后几年直到排卵前才完成，而且减数分裂II期直到受精前才完成。由于甲基化和母系印记发生在减数分裂期，所以由于精子和卵子减数分裂开始和持续的时间不同 ^[21] ，认为虽然父系印记在受精前很早就建立，但是母系印记在配子ART体外操作过程中更容易受到干扰而发生改变。植入前期亦是DNA甲基化容易发生改变的时期，不同物种发生改变的具体时间不同 ^[23] ，有的始于6细胞或8细胞期，有的始于囊胚期。早在受精后4小时，发生去甲基化重新建立表观遗传改变，在这个早期植入前基因组范围大规模去甲基化时，印记位点受到保护以维持亲本特异性甲基化印记，如果保护缺失就可能导致印记异常 ^[22] 。

配子和早期胚胎形成期是甲基化印迹擦除、建立和维持的关键窗口期，而此期恰为辅助生殖技术体外干预阶段，可能干扰基因组印迹的建立和维持，导致遗传性印迹病的产生。目前仍不清楚ART引起基因印记异常的具体原因及其机制，相关动物研究表明胚胎体外培养和相关操作均有可能与引起基因组印记异常 ^[24] 。可能的机制总结如下：

（1）操作对配子的影响：最早报道认为ICSI是引起子代患AS最主要的危险因素 ^[18] 。可能的原因包括：人类15号染色体的母系甲基化印迹排卵前尚未建立，而建立于受精时或之后，而大多数AS的印迹缺失均发生于此期 ^[25] ，所以认为AS的发生可能与ICSI有关。 ICSI操作的影响：ICSI注射之前取出卵丘的操作可能改变卵子正常的减数分裂，显微注射过程造成机械损害同时避开了对精子的自然选择可能选择缺陷精子进行受精，而且将精子顶体及消化酶类引入卵胞浆也可能破坏卵胞浆内环境。但是2003年3个报道共19例BWS患者中只有9例是ICSI出生 ^[16,26] 。

（2）胚胎体外培养 多个研究报道胚胎体外培养会引起基因印记改变，比如将鼠胚在体外M16液中培养会导致H19、IGF2、Grb10等基因印记改变 ^[27] ；在Whitten’s培养液中培养会引起H19基因印记缺失 ^[28] ，通过克隆获得的鼠胚也会引起多个基因印记改变等。

（3）超排卵和不孕 尽管早在2002年就有报道ICSI出生的BWS患者父亲都有精子异常认为印记缺陷可能与男性不育有关 ^[12] ，此后的研究观点仍有很大差异，有的发现ART相关印记缺陷主要与母系位点低甲基化、超排卵和胚胎体外培养有关 ^[29] 。另有发现 不孕不育 本身更能引起潜在的印记缺陷，而且超排卵比ICSI的风险更大，由于所选对照组是IVF出生儿童，所以不能排除配子/胚胎体外培养或胚胎操作是否会增加印记缺陷 ^[14] 。最近一项研究 ^[30] 第一次报道了精子数低于10×10 ⁶ 男性不育患者配子发生印记基因甲基化异常的风险大大增加，他们通过亚硫酸氢盐基因组测序比较少精子症患者与正常对照组H19、MEST印记基因甲基化模式，发现15例少精子症患者中有7例（46.7%）表现H19和/或MEST印记基因缺陷，其中2例既有H19低甲基化又有MEST超甲基化，另外5例只有一种基因缺陷，研究还表明不同形式的甲基化可发生于同一个病人但是严重少精子症患者也可能产生印记正常的精子。

4．能否改变IVF/ICSI引起的印记改变

   目前认为改变发生在配子期的基因印记的建立和胚胎植入前期表观遗传重建均是有可能的。许多动物研究发现改变胚胎体外培养液的成分可以导致印记基因的改变 ^[27,28,31] ，如标准培养液加氨基酸可引起H19印记基因双亲表达，改变培养液成分可改变IGF2-H19的DNA和组蛋白甲基化。在羊和牛的研究中发现的“大仔综合征”(large offspring syndrome ,LOS)是一种子代体积偏大、出生死亡率高的疾病，可能与体外操作过程中印记基因和表遗传重建发生异常有关 ^[32] ，进一步分析发现与体外培养后IGF2R甲基化缺失有关 ^[11] 。羊的LOS模型在体外也可以通过补充培养基增加囊胚细胞数量、囊胚体积以及从而增加影响发育重要基因的转录建立。但是人类并没有IGF2R基因印记，所以人类植入前胚胎表遗传改变可能通过其他路径改变，目前还没有明确。除了培养液成分以外，其他的相关因素如铵离子浓度、氧分压、温度及冷冻保存等也有可能改变基因印记的建立、修饰，可进一步实行相关方面的研究。

综上所述，虽然与IVF/ICSI相关的基因印记疾病发生比例相对较高，实际发生还是比较罕见，并不影响其广泛的临床应用，而且目前也无法得出ART一定增加先天性印迹疾病发生率的结论，需要进行更多的多中心大样本临床随访研究。但是以往众多的动物实验和临床研究均表明此IVF/ICSI可引起基因印记改变引起相关疾病，而且通过一定的操作有可能人为改变基因印记，这为我们更进一步探索各个印记基因之间的相互作用机制、ART相关基因印记疾病发生机制，利用印记调控机制对辅助生殖相关异常印记基因进行干预以获得完全健康子代带来希望。

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