β-catenin与cyclinD1在宫颈鳞癌中的表达及意义

【摘要】目的： 通过观察宫颈鳞癌组织中β-连环素（β-catenin）与细胞周期素D1（cyclinD1）的表达，探讨它们在 宫颈癌 发生、发展过程中的作用。 方法 ：应用免疫组织化学法观察宫颈鳞癌、宫颈上皮内瘤样病变(CIN)、正常宫颈组织中β-catenin与cyclinD1的表达特点，结合临床病理资料进行统计学分析。 结果：（ 1）β-catenin在正常宫颈组织（N=8）、宫颈上皮内瘤样病变（N=20）及宫颈鳞癌（N=42）中的异常表达率分别是0%、35.0%及64.3%，三组间比较差异有统计学意义（P < 0.05）；β-catenin在宫颈鳞癌不同组织分级中异位阳性表达分别为：Ⅰ级25.0%；Ⅱ级63.6%；Ⅲ级91.7%（P < 0.01）。在宫颈鳞癌淋巴结阳性组，β-catenin异位阳性表达率高于淋巴结阴性组（P >0.05）（2）cyclin D1在三组中的阳性表达率则分别是0%、30.0%和61.9%，三组间比较差异有统计学意义（P < 0.05）；cyclinD1的过度表达也与 宫颈癌 组织分级相关，Ⅰ级:37.5% ；Ⅱ级:54.6 %；Ⅲ:91.7%，三组间相比差异有统计学意义（P < 0.05），CyclinD1在宫颈鳞癌淋巴结阳性组与阴性组的阳性表达率分别为70.0%和59.4%，差异无统计学意义（P > 0.05）。（3）β-catenin异常表达与cyclinD1的阳性表达呈正相关（r=7.885）。 结论 ：1） 宫颈癌 中存在β-catenin和cyclinD1的异常表达，随着正常宫颈组织→CIN→宫颈鳞癌的进展，β-catenin及CyclinD1的异常表达呈递增趋势且两者存在明显的相关性。提示Wnt/β-catenin信号通路在宫颈鳞癌的发生发展中可能起重要的作用。2）β-catenin异位表达及CyclinD1阳性表达均与宫颈鳞癌分化相关，但均与淋巴结是否转移无关 关键词 ：宫颈鳞癌；宫颈上皮内瘤样病变；β-连环素；细胞周期素D1；Wnt信号传导通路 冀中能源邢台矿业集团总医院妇科史慧星

中图分类号：737.33 文献标识码：A 文章编号：

Expression of β-catenin and cyclin D1 in squamous carcinoma of the uterine cervix   and Its significance shi Hui Xing ,Han Cai Li. Department of xingtai minning indurstry group co,ltd general  Hospital 054000

【Abstract】Objective: To investigate β-catenin and cyclinD1 expression in squamous carcinoma of the uterine cervix and the possible role of β-catenin and cyclinD1 in the tumor’s development and progression. Methods: Expression of β-catenin and cyclin D1 in squamous cervical carcinomas were studied by immunohistochemistry. The results were  analysized statistically with clinical-pathological data. Results: ①Ectopic expression rate of β-catenin in normal cervical tissues ( control, n=8),cervical intraepithelial neoplasia (CIN ,n=20) and squamous cervical carcinomas (SCC, n=42) was 0%,35.0%,and 64.3% respectively(P < 0.05 ), abnormal expression of β-catenin was significantly correlated with histologic grade (P < 0.01) but not with  lymph node status （P > 0.05） in squamous cervical carcinomas.②Overexpression of cyclinD1 was found in 0% ,30.0% 61.9% ,respectively( P < 0.05); CyclinD1 expression was correlated with tumor differentiation （ P < 0.05） but not lymph node involvements （ P > 0.05）.③ Abnormal expression of β-catenin was correlated with overexpression of cyclinD1in  squamous carcinoma of the uterine cervix carcinoma （ r=7.885 ）. Conclusion: Abnormal expression ofβ-catenin is correlated with expression of cyclinD1 in squamous cervical carcinoma which  indicates that Wnt signaling passway may play an important role in the cervical tumor development and progression.

Keywords : squamous carcinoma of the uterine cervix ; cervical intraepithelial neoplasia; β-catenin; Cyclin D1; Wnt signaling passway

宫颈癌 是女性常见恶性肿瘤, 近年来有年轻化趋势。随着各种诊断和治疗手段不断发展， 宫颈癌 的治疗效果有所改善，但远期效果仍不尽理想，大多数患者死于肿瘤的转移及复发。研究表明， 宫颈癌 的发生发展是多因素多阶段演变的结果，多种癌基因及抑癌基因参与了癌变过程。今后的目标是在力争早期诊断的同时，在分子生物学基础上确定 宫颈癌 发生及发展的始动环节，采用针对性的靶向治疗。

Wnt信号传导通路是一种对控制胚胎发育有重要作用，进化上保守的信号传导通路，决定细胞的分化和增生。研究表明Wnt信号传导通路不恰当的激活参与了多种人类肿瘤的发生和发展。Wnt通路致癌的关键是β-catenin 降解障碍致使胞质内游离的β-catenin聚集并与 Tcf/lef 结合进入胞核,激活下游靶基因 CyclinD1 的转录,导致肿瘤的发生。Wnt 信号通路途径的改变在 大肠癌 发生中的作用已较明确， 在其他恶性肿瘤中的改变也显示出重要意义，深入了解该途径的特点及其在 宫颈癌 中的变化对于 宫颈癌 的早期诊断、预后判断及靶向治疗研究具有重要的意义。本研究应用免疫组化方法检测正常宫颈鳞状上皮组织、宫颈上皮内瘤样病变（Cervical Intraepithelial Neoplasia ，CIN）、宫颈鳞癌组织中β-catenin与CyclinD1的表达情况，分析其表达率的变化，探讨它们在Wnt信号通路中对宫颈鳞癌发生、发展的作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象 标本来源于2007年4月—2008年12月期间河北省邢台市人民医院及邢台矿业集团总医院病理科 宫颈癌 手术和活检的存档蜡块。术前均未行放疗或化疗。宫颈鳞状细胞癌42例，按组织学分级：I 级 8例；Ⅱ级 22例；Ⅲ级 12例。其中有淋巴结转移者10例（23.8%），无淋巴结转移32例。患者平均年龄48.9岁（31-68岁）。宫颈上皮内瘤样病变（CIN）20例（CINⅡ 9例，CINⅢ 11例），正常宫颈组织8例作为对照。

1.2 试验材料 β-catenin 鼠抗人单克隆抗体为ZYMED公司产品。CyclinD1 兔抗人多克隆抗体为Labvision公司产品。羊抗鼠二步法通用型试剂盒。羊抗兔二步法通用型试剂盒。EDTA抗原修复液。封闭用正常山羊血清工作液。显色底物：3，3-二氨基联苯胺（DAB）。（以上试剂均购自北京中山生物技术有限公司）

1.3 方法（1） 采用β-catenin免疫组化染色：二甲苯脱蜡10分钟×2，梯度酒精入水（100％×1、90％×1、80％×1）各10分钟，PBS缓冲液5分钟×1 ，在3％甲醇-过氧化氢混合液室温15分钟，灭活内源性过氧化物酶，PBS缓冲液5分钟×3，EDTA抗原修复液，微波炉高火2.5分钟，解冻档10分钟，室温冷却30分钟，PBS缓冲液5分钟×3，10％山羊血清封闭，湿盒内室温30分钟，β-cat 鼠抗人单克隆抗体（工作液1：100），湿盒内4℃过夜，PBS缓冲液5分钟×3，羊抗鼠二步法工作液湿盒内室温30分钟，PBS缓冲液5分钟×3，DAB显色液，组织显色后用自来水中止反应，Mayer氏苏木素染液20秒，自来水冲洗，酒精脱水（80％×1、90％×1、100％×1）各10分钟，二甲苯透明，中性树脂封片。 （2） cyclin D1免疫组化染色。方法同上，以cyclinD1 兔抗人多克隆抗体和羊抗鼠二步法工作液代替β-cat 鼠抗人单克隆抗体和羊抗鼠二步法工作液。

1.4 结果判定 β-catenin： 正常表达定位于细胞膜，细胞膜上有均匀的棕黄色着色，而胞浆中无染色或仅有微弱着色。细胞膜染色明显减弱或消失同时胞浆或细胞核着色则判定为异常表达。CyclinD1： CyclinD1染色后棕黄色颗粒位于细胞核为阳性，以阳性细胞计数。染色细胞小于5%为阴性（-），大于5%阳性细胞为阳性（+）。

1.5 统计学处理 用SPSS11.5统计软件包进行统计分析。采用卡方检验，四格表确切概率法和Spearman相关分析，P<0.05认为有统计学意义。

2 实验结果

2.1 β-catenin在正常宫颈组织，CIN及 宫颈癌 中的表达  β-catenin在8例正常宫颈鳞状上皮组织中均未见异位表达(图 4-5)，在CIN、宫颈鳞癌的异位阳性表达率分别为35.0%（7/20）、64.3%（27/42），二者差异有统计学意义（P < 0.05）。正常宫颈组织中β-catenin 主要为胞膜表达,在CIN和宫颈鳞癌中β-catenin胞膜表达明显减弱或缺失,随着病变的发展 , β-catenin逐渐呈现细胞浆内表达，而宫颈鳞癌中胞质的表达进一步增强，但本组未发现有明显的细胞核内表达(图 6-7)。β-catenin在宫颈鳞癌不同组织分级中异位阳性表达分别为：Ⅰ级25.0%（2/8）；Ⅱ级63.6%（14/22）；Ⅲ级91.7%（11/12），表明随着 宫颈癌 的组织分级增高,β-catenin异位阳性表达逐渐增强，三组间表达差异有统计学意义（P < 0.01）；CIN组因例数较少未再行不同分级间比较。宫颈鳞癌淋巴结转移组β-catenin异位阳性表达率80.0% (8/10)；高于无淋巴结转移组异位阳性表达率59.4% (19/32)，两组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）（表1-2）。

2.2 Cyclin D1在正常宫颈组织，CIN及 宫颈癌 中的表达  CyclinD1在正常宫颈上皮细胞中（8例）均未见阳性表达，CyclinD1阳性表达定位于细胞核(图10-11)。CyclinD1在CIN、宫颈鳞癌组阳性表达率分别为30.0%（6/20）级61.9%（26/42），两组间比较差异有统计学意义 (P < 0.05) (表1)；在宫颈鳞癌组织分级中CyclinD1阳性表达率分别为：Ⅰ级37.5%（3/8）；Ⅱ级54.6%（12/22）；Ⅲ级91.7%（11/12），即随宫颈鳞癌分级增高Cyclin D1阳性表达率也明显增加，差异有统计学意义 (P < 0.05)。CyclinD1的阳性表达是否出现与淋巴结转移无关联（P > 0.05）(表1-2)。

2.3 宫颈癌 组织中β-catenin与CyclinD1表达之间的关系　在 宫颈癌 组织中β-catenin与CyclinD1共阳性表达有21例，共阴性表达有10例，β-catenin的异常表达与CyclinD1的阳性表达呈正相关（r=7.885）表3。

表1 β-Catenin 、CyclinD1 在 宫颈癌 、CIN 及正常对照组中的表达

表2 β-Catenin 、CyclinD1 在 宫颈癌 中的表达与组织分级及淋巴结转移的关系

表3  β-Catenin 与CyclinD1 在宫颈鳞癌中表达的相关性

β-catenin 细胞膜正常表达 100×

β-catenin 细胞浆异位表达 100×

CyclinD1 阳性表达 40×

CyclinD1 阴性表达 40×

3 讨论

β-连环素(β-catenin)是一种多功能的胞浆蛋白，既能与E-钙粘素(E-cadherin)组成复合体，又是Wnt信号传导通路的重要调控因子，参与细胞的生长分化、黏附、组织修复、肿瘤发生及转移。正常情况下，β-catenin与E-cadherin的胞浆部分形成β-catenin / E-cadherin复合体，定位于细胞膜，维持上皮细胞的极性和完整性。在胞浆中β-catenin的水平通过两组蛋白质的功能竞争来调节：一组为破坏复合体，是由GSK3、Axin及APC组成的一种较大的蛋白复合体，起破坏β-catenin的作用，使它保持低水平，从而关闭Wnt信号传导通路；另一组为拮抗蛋白类，在对Wnt信号反应时被活化，起拮抗破坏复合体的作用，使β-catenin的水平升高，开启Wnt信号传导通路 ^{[1 ，2]} 。正常情况下，β-catenin在细胞内保持低水平，Wnt信号传导通路处于关闭状态。CyclinD1 是Wnt信号传导通路的下游靶基因之一 ^[3] 。当Wnt/β-catenin途径处于激活状态时，β-catenin蛋白在细胞浆及胞核中累积，作用于cyclinD1启动子中LEF-1结合位点而激活其转录，cyclinD1与细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin dependent kinases ，CDKs） 结合并激活后者，诱导成人视网膜细胞瘤易感基因（Rb）产物的磷酸化。使Rb与转录因子E2F解离，游离的E2F进入细胞核内促进基因转录，使细胞完成由G ₁ 期到S期的转换进入增殖阶段 ^{[ 4 ]} 。目前已知人类多种恶性肿瘤中存在Wnt/β-catenin通路激活。免疫组织化学研究已表明在宫颈鳞状细胞癌中发现β-catenin和cyclinD1的异常表达及高表达 ^{[ 5-9 ]} ，但在Wnt信号通路中，cyclinD1作为β-catenin主要调节的靶基因，两者在 宫颈癌 中表达的相关性尚不明确，未见相关报道。本文对42例宫颈鳞癌进行了β-catenin和cyclinD1蛋白表达的相关性进行了研究，以进一步观察Wnt信号通路在该肿瘤发生发展中的作用。

本研究结果显示: β-catenin及cyclinD1在宫颈鳞癌中的异位表达及过表达分别达64.3 %及61.9%，与其他文献报道相似 ^{[ 5-9 ]} 。相关分析显示两者存在明显相关性（r=7.885），且随着正常宫颈组织→CIN→鳞癌的转化，β-catenin及cyclinD1的异常表达呈递增趋势，说明Wnt/β-catenin通路的激活与宫颈鳞癌的发生密切相关。本结果还显示了β-catenin异位表达与 宫颈癌 的分级及淋巴结转移成正相关（ P<0.05 及 P=0.05 ）表2，而cyclinD1在有淋巴结转移组的表达也明显高于淋巴结阴性组（ P<0.05 ），表明β-catenin的异常表达可能与肿瘤的恶性行为和去分化有一定的关系，是肿瘤细胞获得高增殖活性和侵袭性的原因之一。由于本组随访不全，未能做相关预后方面的统计分析。但有文献显示β-catenin的异常表达与 宫颈癌 患者预后无关 ^[9] 。

但目前对Wnt/β-catenin通路在 宫颈癌 中异常激活的具体环节尚不完全清楚。β-catenin基因在 宫颈癌 中突变率并不高，有报道为17%甚至更低 ^{[10 ，11]} ，说明β-catenin基因突变可能仅在少数 宫颈癌 发生及发展中起作用。另有人研究发现APC启动子甲基化在 宫颈癌 中是一个频繁事件，可能参与了Wnt/β-catenin信号通路异常激活 ^{[12 ，13]} 。所以值得进一步研究明确Wnt/β-catenin信号通路在 宫颈癌 中激活的主要环节或机制对 宫颈癌 的综合治疗如靶向治疗，改善预后有重要意义。

综上所述， β-catenin及cyclinD1在宫颈鳞癌中的异位表达及过表达分别达64.3 %及61.9%，且随着正常宫颈组织→CIN→鳞癌的转化，β-catenin及cyclinD1的异常表达呈递增趋势，β-catenin异位表达与 宫颈癌 的分级及淋巴结转移成正相关（ P<0.05 及P=0.05 ）,CyclinD1高表达与 宫颈癌 的分级相关（ P <0.03）,以上结果表明Wnt信号通路可能在宫颈发生发展中起着重要的作用。

参 考 文 献

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