宫清颗粒对人早孕绒毛、蜕膜组织细胞凋亡及信号转导的影响

摘　要 　目的:探讨宫清颗粒对人早孕绒毛、蜕膜组织细胞凋亡及信号转导的影响,为临床防治药物流产后异常子宫出血(简称药流后出血)提供生物学依据。方法:将120例受试者随机分为宫清药流组、茜芷药流组、单纯药流组及负压吸宫组,各30例,收集各组绒毛及蜕膜组织,观察细胞超微结构变化;TUNEL法检测细胞凋亡率(AR)、荧光分光光度计检测细胞内钙离子浓度([Ca ²⁺ ] i)、免疫组化法检测蛋白激酶C(PKC)蛋白表达。结果:宫清药流组绒毛、蜕膜组织细胞超微结构出现典型凋亡改变,AR、[Ca ²⁺ ] i升高, PKC蛋白表达降低,与其它3组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论:宫清颗粒能影响细胞内Ca ²⁺ 及PKC介导的细胞信号转导,诱导人早孕绒毛、蜕膜组织细胞凋亡,促进绒毛与蜕膜组织完全排出,进而防治药物流 产后出血 。 山东中医药大学附属医院妇科刘瑞芬

关键词 　宫清颗粒　绒毛　蜕膜　细胞凋亡　信号转导

    药物流产具备安全、痛苦小等优点,但存在出血时间长、出血量多等问题,个别病例出血时间长达1～4个月,并有6%～10%的不完全流产率及潜在大出血危险 ^[1] 。中药复方宫清颗粒组方是长期应用于临床的有效方剂 ^[2] ,已获国家药品监督管理局新药临床研究批件,并顺利完成Ⅱ期临床研究。本研究从细胞凋亡及信号转导角度探讨宫清颗粒防治药物流 产后出血 的作用机制,为临床应用提供生物学依据,丰富中医学“产后多虚多瘀”理论的科学内涵。

资料与方法

    一、研究对象

    受试对象120例,均为2006年5月～2007年10月就诊于山东中医药大学附属医院妇科门诊者,根据《中华妇产科学》 ^[3] 、《妇产科诊疗常规》 ^[4] 、《中药新药临床研究指导原则》 ^[5] 有关内容拟定病例纳入与排除标准。按照随机数字表,采取随机分组双盲法,将受试对象分为宫清药物流产组(A组)、茜芷药物流产组(B组)、单纯药物产流组(C组)及负压吸宫流产组(D组),每组各30例。

    二、药物与试剂

    米非司酮(国药准字H20000628,批号050501)及米索前列醇(国药准字H10960144,批号050309),均由上海华联制药有限公司生产。宫清颗粒由浙江爱生药业有限公司生产(国家药品监督管理局新药临床研究批件2003L01386)。

    三、服药方法

    1.A组　按药物流产常规方法服用米非司酮和米索前列醇。服米非司酮第1d开始服宫清颗粒, 48g/d,分3次服用,连服3d。

    2.B组　服米非司酮第1d开始服茜芷胶囊(甘肃兰药药业有限公司生产), 15粒/d,分3次服用,连服3d。

    3.C组　药物流产常规方法服用米非司酮及米索前列醇,不服中药。

    4.D组　行负压吸宫流产术。

    四、组织学分析

    1.取材　收集A、B、C组服药后排出的新鲜绒毛各30例和蜕膜组织各20例,D组手术时取得的绒毛和蜕膜组织各30例,立即用生理盐水冲净,常规固定。

    2.透射电镜下细胞超微结构观察　环氧树脂(812)包埋,超薄切片机切片,厚度约60nm,醋酸双氧铀-柠檬酸铅双重染色。JEM-1200EX透射电镜观察,拍照。

    3.TUNEL法检测细胞AR　标本切片HE染色后,脱蜡,蛋白酶K室温孵育20min;滴加50μl的TUNEL反应混合液,于湿盒中37℃孵育60min;加入50μl转化剂POD, 37℃孵育30min;经DAB显色、苏木素核复染后脱水、透明、封片。以上各步骤均用PBS冲洗,阴性对照用不含末端脱氧核苷酸转移酶的TUNEL反应液孵育。图像定量分析:TUNEL阳性反应物定位于细胞核,呈棕黄色,着色阳性细胞为凋亡细胞 ^[6] 。随机选取10个非重叠视野(×100),阳性细胞所占百分率为AR。

    4.荧光分光光度计检测[Ca ²⁺ ] i　日立F-4500型荧光分光光度计设定激发光光栅5nm,发射光光栅10nm,测定温度为37℃。以光谱方式测定Fura-2/AM标准液和负载液的激发光谱,其最大波长由380nm降到340nm,说明Fura-2/AM负载进入细胞内。以时间方式测定(激发波长340nm)Fu-ra-2负载液荧光强度(F值),加入10%TritonX-100,终浓度为0. 1%, 30min后检测最大荧光强度Fmax,加入EDTA,终浓度为5mmol/,l 30min后测得最小荧光强度Fmin。[Ca ²⁺ ] i(nmol/L)=Kd（F-Fmin/Fmas-F）,Kd为Fura-2与Ca ²⁺ 反应的解离常数, 37℃时224nmol/L。

    5.免疫组化法检测细胞PKC蛋白表达变化　标本切片脱蜡, 3%H O 室温孵育10min;漂洗后微波炉抗原修复; 10%正常山羊血清封闭后加一抗孵育4℃过夜;漂洗后滴加辣根酶标记二抗, 37℃孵育30min; DAB显色剂显色后;自来水充分冲洗,复染,封片。采用Leica QW in V3图像分析软件分析结果,蛋白表达强弱与灰度值大小呈负相关,即蛋白表达越强则灰度值越低。

    五、统计学方法

    采用SPSS12.0统计学软件,计量资料结果用均数±标准差( ±s)表示,先采用方差齐性检验,再用组间两两比较q检验、秩和检验进行组间差异的比较,计数资料用x ² 检验。

结　果

    一、一般情况

    经统计学分析, 4组观察对象在年龄、生育情况、 停经 天数及孕囊大小等方面差异无统计学意义,具有可比性。

    二、绒毛、蜕膜组织细胞超微结构观察（图略）

    1.D组　合体滋养细胞、蜕膜细胞表面微绒毛丰富,细胞滋养细胞基底膜正常,滋养细胞、蜕膜细胞核形态正常,核内染色质分布均匀,细胞器正常,颗粒细胞内有大量电子密度高的分泌颗粒,细胞间连接紧密。

    2.C组　合体滋养细胞、蜕膜细胞表面微绒毛脱落,细胞滋养细胞基底膜增厚,滋养细胞与蜕膜细胞核形态不规则,核膜肿胀,出现常染色质团块状,异染色质边集,核固缩等凋亡形态学改变。颗粒细胞内分泌颗粒明显减少,细胞间连接缝隙增宽。

    3.B组　合体滋养细胞、细胞滋养细胞、蜕膜细胞及颗粒细胞超微结构变化与C组相似。

    4.A组　出现凋亡形态学改变,程度较C、B组加重,合体滋养细胞、细胞滋养细胞、蜕膜细胞及颗粒细胞均出现典型凋亡小体,其内包含结构基本正常的细胞器。

    三、AR、[Ca ²⁺ ] i和PKC的变化

    A组绒毛滋养细胞及蜕膜组织细胞AR、[Ca ²⁺ ] i升高,绒毛及蜕膜组织细胞PKC灰度值升高,与其它3组比较差异均有统计学意义(P<0.05),说明A组PKC蛋白表达较其它组降低。

                       表1　绒毛滋养细胞AR、[Ca ²⁺ ] i和PKC的变化( ±s)

  *与D组比较P<0.01　▲与C组比较P<0.05　△与B组比较P<0.05 　▲△与C组比较P<0.01　△△与B组比较P<0.01

                            表2　蜕膜组织细胞AR、[Ca ²⁺ ] i和PKC的变化( ±s)

讨　论

    近年研究认为药物流产后子宫异常出血与绒毛、蜕膜细胞凋亡不足有关 ^[7] ,而米非司酮作用后的绒毛和蜕膜组织细胞表现出凋亡倾向 ^[8] ,本研究结果与报道相一致。中药对细胞凋亡具有调节作用已得到证实,活血化瘀药能诱导细胞凋亡,调节细胞增殖与凋亡平衡 ^[9] ,清热药、补益药能诱导 肿瘤 细胞凋亡 ^{[10, 11]} ,但尚未见有关于中药诱导人早孕绒毛、蜕膜组织细胞凋亡预防药物流 产后出血 的研究报道。本研究观察4组妇女流产后人早孕绒毛、蜕膜组织细胞超微结构变化,发现宫清颗粒用于药物流产后绒毛、蜕膜组织细胞凋亡程度较其它3组高,且该组绒毛、蜕膜AR明显高于其它组,提示宫清颗粒有诱导药物流产人早孕绒毛、蜕膜细胞凋亡的作用。为进一步探讨宫清颗粒这一作用机制,我们对参与细胞生命活动的关键,第二信使Ca ²⁺ 及其重要靶分子蛋白PKC进行了研究。

    Ca ²⁺ 是各条细胞信号传导途径的枢纽,有证据表明[Ca ²⁺ ] i升高可引起细胞凋亡 ^[12] 。近年来,有关药物流产细胞凋亡的研究逐渐深入,但对参与细胞凋亡信号转导的重要因子Ca ²⁺ 超载的研究未见报道。我们首次将[Ca ²⁺ ] i纳入流产药物对细胞凋亡影响的研究,发现宫清颗粒能升高绒毛、蜕膜[Ca ²⁺ ]i提示宫清颗粒可能通过影响Ca ²⁺ 介导的信号转导,诱导人早孕绒毛及蜕膜发生细胞凋亡。在信号通路中PKC是细胞内Ca ²⁺ 作用的重要靶分子蛋白 ^[13] ,它在细胞的生长、分化与凋亡中起重要作用 ^[14] 。PKC活化后通过对靶蛋白分子的丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化而介导多种生物效应 ^[15] ,它能使G蛋白的活化因磷酸化而下调,引起环磷酸腺苷(cAMP)水平增高,诱导细胞凋亡。也有报道PKC活化引起细胞内cAMP水平升高,促进转录导致细胞增殖和分化 ^[16] 。研究发现米非司酮抑制早孕滋养细胞PKC信号转导通路及raf-1瀑布激酶链和分裂激活蛋白,抑制增生分裂并诱导凋亡 ^[17] 。本研究发现宫清颗粒用于药物流产后绒毛滋养细胞、蜕膜组织细胞PKC蛋白表达降低,提示宫清颗可能通过降低PKC蛋白表达,抑制细胞分化增值,诱导凋亡。

    中医认为药物流产乃人为终止妊娠,药物流产后阴血骤虚,气不摄血;或胎堕不全,余血留滞胞宫,瘀血不去,新血难安;或外邪乘袭酿而化热,热伤血络;或三者相互交错,虚实并存,以致恶露不净。“瘀、虚、热”是本病的主要病机,活血祛瘀是治疗本病的关键,瘀去而血行,养血益气是治疗本病的基础。宫清颗粒君药益母草活血祛瘀,清热止血;臣药马齿苋、生蒲黄、牛膝助君药活血化瘀,凉血止血;佐药当归、党参养血益气,活血化瘀;使药甘草补中益气,调和诸药;实验证实该药能协同米非司酮抗早孕,提高完全流产率,缩短阴道出血时间,减少阴道出血量,不影响卵巢排卵功能及月经恢复 ^[2] ;药效学实验表明宫清颗粒能明显兴奋子宫平滑肌,缩短出凝血时间、增加雌激素含量,有抑菌和镇痛作用 ^[18] ,并发现该药有诱导绒毛细胞凋亡倾向 ^[19] 。通过本研究发现该方能诱导人早孕绒毛、蜕膜组织细胞凋亡,促进绒毛与蜕膜组织完全排出,进而防治药流后出血。对Ca ²⁺ 和PKC介导的细胞信号转导的调节可能是其作用机制之一。但细胞内Ca ²⁺ 的来源及其在诱导绒毛、蜕膜组织细胞凋亡中的确切机制尚未明确,此方向的深入研究将进一步揭示本病发病机理及药物防治机制。

参考文献（略）

                                           医学博士   李霞等整理